miRNA的人工合成主要依赖固相化学合成技术，通过在体外精准拼接核苷酸单体形成目标序列，其过程需严格控制每一步的化学反应效率，确保序列准确性和结构完整性。以下是详细的合成方法与关键步骤：
一、核心原理
人工合成miRNA的本质是将单个核苷酸（A、U、C、G）按照目标miRNA的成熟序列（如miR-200c的序列为5-UAAUCGAAUUGGAUGACUGAA-3），通过磷酸二酯键依次连接，形成长度约20-24nt的单链RNA分子。由于RNA分子易降解，合成过程中需通过化学修饰（如碱基保护、骨架修饰）提高稳定性，同时利用固相载体固定链的一端，便于分离纯化。
二、关键材料与工具
1. 原料：带保护基团的核苷酸单体（如2-O-叔丁基二甲基硅基保护的腺苷、尿苷等），每种单体的5羟基和碱基氨基均有保护基团（防止非特异性反应）；
2. 固相载体：通常为可控孔度玻璃珠（CPG），表面连接有第一个核苷酸的3端（作为合成起点）；
3. 试剂：脱保护剂（如三氟乙酸）、偶联剂（如苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐）、氧化剂（如碘溶液）、切割试剂（如浓氨水）；
4. 设备：全自动核酸合成仪（控制反应步骤与时间）、高效液相色谱（HPLC）、质谱仪（验证分子量）。
三、详细合成步骤
1. 固相载体预处理
将连接有第一个核苷酸（3端）的CPG载体装入合成柱，用乙腈冲洗去除杂质，确保载体表面洁净，为后续反应做准备。第一个核苷酸的选择由目标miRNA的3端序列决定（如miR-200c的3端为A，则第一个连接的是腺苷单体）。
2. 脱保护（Deprotection）
- 目的：去除上一个核苷酸5端的保护基团（通常为4,4-二甲氧基三苯甲基，DMT），露出游离羟基，以便与下一个核苷酸连接。
- 过程：向合成柱中加入脱保护剂（如3%三氟乙酸的二氯甲烷溶液），反应1-2分钟，DMT基团被切割并释放（溶液呈橙色，可通过比色法监测反应完全性），随后用乙腈冲洗去除残留试剂和副产物。
3. 偶联（Coupling）
- 目的：让新加入的核苷酸单体与已合成链的5端游离羟基形成磷酸二酯键，延长核苷酸链。
- 过程：
- 将带保护基团的核苷酸单体（溶于乙腈）与偶联剂混合，形成活性中间体（增强与羟基的反应活性）；
- 注入合成柱，与脱保护后的核苷酸链5端羟基反应，反应时间约15-30秒，偶联效率需达到99%以上（确保长链合成的准确性）；
- 用乙腈冲洗，去除未反应的单体和试剂。
- 关键：偶联效率是合成成功的核心，若效率低于99%，合成20nt的miRNA时总正确率将低于82%（0.99²⁰≈0.82），因此需通过优化试剂浓度和反应时间确保高效偶联。
4. 加帽（Capping）
- 目的：封闭未参与偶联的游离羟基（约1%），防止其在后续步骤中与其他单体反应，产生错误序列（如缺失或错配）。
- 过程：向合成柱中加入加帽试剂（通常为乙酸酐与N-甲基咪唑的混合液），反应30秒，使未反应的羟基乙酰化，形成稳定的封闭结构，随后用乙腈冲洗。
5. 氧化（Oxidation）
- 目的：将新形成的亚磷酸三酯键（不稳定）氧化为磷酸三酯键（稳定），避免链断裂。
- 过程：注入氧化剂（如0.1M碘的四氢呋喃/吡啶/水溶液），反应30秒，亚磷酸基团被氧化为磷酸基团，随后用乙腈冲洗。
6. 循环延伸
重复步骤2-5（脱保护→偶联→加帽→氧化），每次循环添加一个核苷酸，直至合成完整的miRNA序列（如22nt需循环21次）。每一步均通过自动化仪器控制，确保序列严格按照设计顺序延伸。
7. 切割与脱保护（Cleavage & Deprotection）
- 目的：将合成的miRNA链从固相载体上切割下来，并去除碱基和磷酸基团上的所有保护基团。
- 过程：
- 向合成柱中加入切割试剂（如浓氨水），55℃下反应12-16小时，使miRNA链与固相载体分离，同时去除碱基上的保护基团（如胞嘧啶和腺嘌呤的苯甲酰基、鸟嘌呤的异丁酰基）；
- 离心收集上清液，真空干燥去除氨水，得到粗品miRNA（含少量短链杂质和盐类）。
8. 纯化（Purification）
- 目的：去除粗品中的未完全合成的短链、盐类和试剂残留，获得高纯度miRNA。
- 常用方法：
- 反相高效液相色谱（RP-HPLC）：利用miRNA与固定相（如C18柱）的疏水相互作用，通过梯度洗脱（乙腈浓度从5%升至40%）分离不同长度的核苷酸链，目标miRNA（20-24nt）因疏水作用差异被单独洗脱；
- PAGE凝胶电泳：将粗品加载到20%变性聚丙烯酰胺凝胶中，电泳后切下目标长度的条带，用缓冲液浸泡回收，再通过乙醇沉淀去除凝胶杂质。
9. 修饰与活性优化（可选）
为提高miRNA的稳定性和功能，可在合成后进行化学修饰：
- 2-O-甲基化修饰：在核糖的2位引入甲基，增强对核酸酶的抗性；
- 硫代磷酸骨架修饰：将磷酸二酯键中的一个氧原子替换为硫原子，提高抗降解能力；
- 末端修饰：在3端添加胆固醇或脂肪酸链，增强与细胞膜的结合能力（适用于递送）。
10. 质量验证
- 纯度检测：通过HPLC或 capillary electrophoresis（毛细管电泳）检测，纯度需≥95%；
- 序列验证：采用质谱（如ESI-MS）测定分子量，与理论值比对（误差需≤0.1Da），或通过Sanger测序确认碱基序列；
- 活性验证：将合成的miRNA转染至细胞中，通过qPCR检测靶基因的表达变化（如激活型miRNA应使靶基因表达上调），验证其功能与天然miRNA一致。
总结
人工合成miRNA通过“固相合成-循环延伸-纯化修饰”的流程，实现了对miRNA序列的精准控制，其核心优势在于可定制化生产单一序列、高纯度的miRNA，并通过化学修饰优化稳定性和功能。该方法虽成本较高（依赖高精度仪器和高纯度原料），但仍是目前获取功能性miRNA用于研究和应用的最可靠手段，尤其适用于组织修复等场景中对特定miRNA（如miR-200c、miR-205）的定向制备。
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